地理相关的真菌-细菌互作贡献了高复杂度自发发酵过程中地理依赖性风味的形成

Geographically Associated Fungus-Bacterium Interactions Contribute to the Formation of Geography-Dependent Flavor during High-Complexity Spontaneous Fermentation

Research Article，2022-9-22，Microbiology Spectrum， [IF 9.04]

DOI：https://doi.org/10.1128/spectrum.01844-22

第一作者：谭煜炜；杜海

通讯作者：徐岩

主要单位：江南大学

- 引言 -

传统发酵食品（如酒类、发酵调味品等）伴随着人类文明的长期发展，是日常生活不可或缺的一部分。传统食品自发发酵，不仅对于食物保存具有重要意义，还产生了有许多吸引人的独特风味。来自不同地理区域的发酵产品往往具有独特的风味特征，丰富了人们日常的饮食生活。因此，探究地域性风味是如何形成的，将有助于区域性发酵食品的异地生产，以满足更广泛的人群需求。

中国白酒，是历史悠久的且广受消费者青睐的传统发酵食品之一。白酒多菌种（细菌、酵母、霉菌等）固态双边发酵（边糖化边自发发酵）的复杂发酵工艺，在千年传承与创新的过程中，诞生了多种区域偏好的发酵香型。其中，清香型、浓香型和酱香型是三种最具代表性的白酒香型。早在20世纪70年代，当时全国各地酒厂纷纷按照名酒企业的生产工艺仿制过名酒（其中最著名的就是“异地茅台”实验），期望突破白酒发酵风味地域限制，但经验式的模仿异地生产差异很大。除地域气候、原料与设备等因素外，不同香型白酒发酵菌群的复杂性、未表征的微生物代谢作用以及有限的菌群发酵调控措施，使得典型白酒香型的异地生产成为长期以来困扰行业发展的关键谜题。随着高通量测序与微生物组学技术的发展，白酒发酵菌群的多样性及其对香型形成的贡献逐渐清晰。近期，徐岩团队通过对中国白酒发酵过程的大规模采样分析，在Microbiology Spectrum上发表了有关中国白酒产区地域微生态酿造优势的新研究。

- 实验设计 -

中国白酒的自发固态发酵在窖池中进行，清香型和酱香型白酒发酵持续约 30 天，浓香型白酒发酵持续约 60 天。为了评估风味化合物和微生物生态的地理特征，从全中国 9 个代表性酒厂收集了 403 个发酵样品，其中包括 101个清香型发酵样品、98个浓香型样品和 204 个酱香型样品（如图1）。收集的发酵样品分别涵盖了每个香型发酵的五到六个发酵批次，并通过控制发酵过程中相同的时间和空间取样间隔，来保证取样的一致性。通过联合代谢组学、高通量扩增子测序、宏转录组学、宏基因组学和可培养验证等技术手段，揭示并验证了影响地域性风味形成的微生物因素，为明确中国白酒产区的地域微生态酿造优势提供了新证据。

图1 不同地区代表性酒厂发酵采样示意图。

采样点用圆点标记，不同颜色圆点代表不同白酒香型，括号中的数字表示样本量

图2 不同白酒香型样品挥发性组分的地域性

(a)主成分分析图显示清香、浓香 和酱香型403个发酵样品不同的挥发性组分的聚类; (b) 发酵样品挥发性组分相似度与地理的关联特征

白酒发酵微生物组的区域生态特征

三种香型的发酵样品中总计注释了 735 种细菌属和 290 种真菌属。我们发现高丰度的微生物属（相对丰度> 0.1％）不同香型产区间是相似的，占总细菌或真菌相对丰度的90％以上（如图3a），但优势菌群结构仍有差异，如清香型样品中Saccharomyces、Hyphopichia、Aspergillus的相对丰度较高，浓香型Pseudomonas、Kazachstania、Candida的相对丰度较高，酱香型Bacillus、Pichia的相对丰度较高。不同香型产区间低丰度微生物属差异巨大。非度量多维尺度标定分析(NMDS)发现不同香型产区区域微生物形成明显的分类簇，ANOSIM分析确定了其差异的显著性。其中，真菌群落差异较大，细菌群落差异相对较小，说明优势真菌对于香型产区变化更为敏感。真菌和细菌结构特征都与纬度显著相关（图3c）。真菌结构与纬度（R² = 0.494; P < 0.001）比与经度（R² = 0.054; P < 0.001）表现出更显著的线性关联，表明不同香型产区发酵真菌结构具有纬度依赖的生态特征。

图3 不同香型产区区域微生物生态特征

(a)高丰度微生物属结构；（b）细菌和真菌群落结构的非度量多维尺度（NMDS）分析；(c) 不同香型产区微生物的生态特征分析

地域风味特征物质与微生物群体的联系

通过Mantel分析发现细菌和真菌都有助于产区特征优势的形成。基于双向正交偏最小二乘 (O2-PLS) 建模，发现清香型白酒发酵中的69个核心细菌属和87个核心真菌属，浓香型白酒发酵中的39个核心细菌属和34个核心真菌属，酱香型白酒发酵中的35个核心细菌属和13个核心真菌属与产区特征风味物质显著关联。大多数酸、醇、醛、酯和其他芳香族化合物等产区特征风味物质都是由真菌和细菌共同贡献的（如图4a）。变异分区分析（VPA）表明，真菌-细菌相互作用对地理依赖性风味的贡献大于单独来自细菌或真菌的贡献（如图4b）。

图4 产区特征风味物质的形成模式

(a) 特征风味物质和微生物的相互关联频率；(b) 真菌、细菌及真菌-细菌相互作用对产区特征风味物质形成的贡献比例

分子生态网络表征了所有特征风味物质与核心微生物群落之间的详细关联（如图5）。整体而言，清香型发酵和浓香型发酵样品中，特征风味物质与核心微生物群落之间的关联冗余度比酱香型发酵更高，网络低关联冗余度往往表现出对于外界环境变化较低的抵抗力，这解释了酱香型发酵产区形成对于区域更加敏感的特征。白酒发酵中丰富的微生物资源和网络预测的真菌-细菌相互作用，有望帮助我们在可预见的未来设计一个合成微生物群落，以重现各种所需的风味特征，从而逐步突破地域限制的难题。

图5 产区特征风味物质与核心微生物群落在

(a)门和(b)属分类水平的详细显著关联

地域风味特征物质的真菌-细菌协作代谢机制

通过分子生态网络分析发现，相同的真菌和细菌属在不同的环境下表现出不同的真菌-细菌及微生物-代谢物相互关系（如图6）。

图6 相同功能菌属映射不同相互作用和特征风味代谢物关联模式

以酱香型白酒发酵为例，我们通过宏转录组学技术，确定了部分真菌-细菌代谢相互作用贡献特征风味物质的基因和途径（如图7）。通过对特征风味物质代谢模式的分析，发现真菌-细菌代谢相互作用是动态的（互作强度随发酵时间变化），且大部分特征风味物质的最终合成需要依赖化学反应，这说明白酒发酵菌群特征风味物质的代谢容易受到发酵参数（如温度影响美拉德反应）和相互作用概率、强度及持续时间的影响。因而，相同的发酵微生物群落可能在不同发酵环境下具有差异代谢轮廓。

图7 酱香型发酵过程中代表性风味特征物质的合成途径及分子机制

白酒发酵微生物组的群落组装模式

通过基因组测序发现，相同微生物属下可能存在多个具有功能差异的微生物菌株，且在初始菌群结构上具有丰度差异。因而，除发酵参数的确定性作用外，这种从发酵接种开始便存在的微生物差异，可能对于发酵过程菌群组装与代谢也具有影响（如图8）。通过分析菌群组装模式，发现发酵菌群存在随机组装过程，菌群动态演替对于特征风味物质的贡献在一定程度上存在随机性，这解释了大规模白酒工业化生产实践过程中，优质发酵批次的比例往往存在概率瓶颈。同时，不同香型发酵过程菌群组装模式的具有不同的动态变化周期，这可能是不同香型白酒发酵过程时长不同的原因之一。

图8 不同香型白酒发酵过程的

(a)初始菌群结构差异、(b)基因组多样性与(c)群落组装模式

微生物群落特征风味物质代谢调控的策略与验证

基于菌群特征风味物质的代谢模式及群落组装模式调控要点，我们设计了两个合成菌群的模拟发酵实验以验证特征风味物质代谢调控的可行性。首先，图9a结果验证了调整相同菌群的不同初始结构，可代谢不同浓度的特征风味物质。其次，图9b结果验证了调整相同微生物菌株相互作用发生的时间，可影响代谢特征风味物质的代谢轮廓。

图9 通过设计

(a)不同初始菌群结构和(b)真菌-细菌互作强度调控模拟发酵

- 总结 -

该研究通过多组学技术联用，为中国白酒产区地域微生态酿造优势提出了新证据。主要结论：

（1）中国白酒不同香型的风味特征主要体现在约20 到 40 个不同的特征风味化合物的组成上。白酒微生物菌群的区域生态特征主要体现在纬度依赖性真菌结构上。差异的区域微生物生态，通过约48到156个核心微生物物种的共同作用，形成了不同香型白酒的产区特征优势；

（2）真菌-细菌相互作用对于产区特征优势形成的贡献大于细菌或真菌单独的贡献；

（3）基于真菌-细菌相互作用与菌群组装模式，解密了白酒发酵优质率、发酵时长特征的成因，并据此提出、验证了调控菌群特征风味物质代谢的可行方式。

-后记 -

酿造微生物与应用酶学课题组成员张红霞、方程、靳光远、陈双、吴群，上海交通大学副研究员张梦辉、研究员张延等参与了相关研究工作。