一、微生物组定量分析的挑战

(1) 提高微生物组定量分析的准确性

微生物组定量分析是根据相对微生物组分析和加标标准、总微生物群落或本地内部标准的丰度计算的。微生物标准的量化可能容易出错。对于使用加标标准4的方法，微生物组定量分析结果会受到加标标准提取过程中的 DNA 损失和加标标准浓度水平的影响。具有最佳浓度的梯度加标标准可以校准误差并进一步提高微生物组定量分析的准确性。对于基于总微生物群落或本地内部标准的方法，定量微生物组分析结果也会受到不同定量方法的缺点的影响，例如 qPCR 的扩增偏差、流式细胞仪检测的背景噪声。因此，有必要进一步开发更多无扩增和无污染的方法来避免这些问题，并结合多种微生物定量方法对总微生物群落或内标丰度进行定量。此外，对于基于本地内标的方法，选择最佳梯度本地内标有助于校准定量结果，进一步提高食品发酵中微生物组定量分析的准确性。

此外，目前的微生物组定量分析方法主要依赖于提取的 DNA 序列。然而，这些方法无法区分活细胞和死细胞。因此，排除死细胞对活菌群定量的影响非常重要。可将单叠氮化丙啶引入常规 qPCR 扩增，以减少死细胞的干扰。此外，成簇规则间隔回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 13a (Cas13a) 系统因其特定的靶激活反式切割能力而被广泛用于识别 RNA (Xue et al. 2022)。使用 CRISPR/Cas13a 系统可以识别和检测活细胞，因为 RNA 序列在死细胞中会迅速降解。最近，开发了一种基于 CRISPR/Cas13a 和基于 RNA 序列的扩增的方法来量化活的肠道沙门氏菌 (Xue et al. 2022)。因此，应开发更多创新方法，例如无扩增方法和基于新型 CRISPR/Cas 系统的方法，以减少死细胞的偏差和干扰，从而提高食品发酵中微生物组定量分析的准确性。

(2) 提高微生物组定量分析的微生物分类分辨率

具有更高分类分辨率的微生物群落的绝对量化可以提高我们对关键微生物分类群和变异的理解。这种更高的微生物分类分辨率分析将促进表征微生物多样性和演替规律。然而，基于操作分类单元 (OTU)分类的高通量扩增子测序的定量微生物组分析只能在门或属水平上量化微生物分类群。因此，提高微生物组定量分析的微生物分类分辨率至关重要。最近，人们提出了一些提高分类分辨率的策略。例如，开发了一种名为分裂扩增子去噪算法 2 (DADA 2) 的算法，以 100% 的相似性水平将读数分类为扩增子序列变体 (ASV) (Callahan et al. 2016)。另一种名为 UNOISE3 的算法也被开发用于以 100% 的序列相似性将读取聚类到零半径操作分类单元 (ZOTU) 中（Edgar 2016）。此外，第三代测序技术，对全长 16S rRNA 基因进行测序，可以在物种水平上量化微生物类群（Johnson et al. 2019）。此外，还开发了一种宏基因组分箱方法来在菌株水平上分选 DNA（Ma、Xiao 和 Xing 2020）。此外，一种新的测序技术通过设计细胞条形码在单细胞水平对微生物群落进行分类（Jin et al. 2022）。这些方法可以提高从属到种的微生物分类分辨率，或食品发酵中微生物组定量分析的菌株水平。未来，有望采用更先进的算法和测序技术，提高微生物组定量分析中的微生物分类分辨率，并进一步说明关键微生物物种甚至菌株在食品发酵中的作用。

(3) 提高微生物组定量分析的效率

目前的微生物组定量分析方法主要基于高通量扩增子测序结果与标准丰度的数据转换。量化过程繁琐，急需更多创新方法摆脱扩增子测序和转化过程。最近，开发了高通量微流控芯片平台以提高微生物定量的效率并扩大多目标分析（Ackerman et al.，2020）。例如，基于高通量微流控芯片的一步检测方法可以快速定量32种微生物靶标，自动化程度高，方便快捷（Xiang et al. 2022）。另一个称为用于核酸多重评估的微流控组合阵列反应 (mCARMEN) 的微流控平台可以同时区分和量化多种病毒（Welch et al. 2022），并可用于食品发酵中的微生物量化。此外，结合实时细胞识别的微流控芯片可以以高通量和高效的方式分离单个细胞（Wang et al. 2021c）。尽管微流控芯片不能一次量化所有微生物类群，但它显示了高通量的好处。未来，预计将在现有多重分析策略的基础上开发更多创新技术。这些创新技术将摆脱目前的扩增子测序，获得一步有效的微生物组定量分析。

二、食品发酵中微生物组定量分析的前景

目前，微生物组定量分析用于评估实际微生物群落分布，它揭示了不同微生物生态系统中的功能微生物（Galazzo et al. 2020；Lin et al. 2019；Tkacz、Hortala 和 Poole 2018）。该方法揭示了肠道菌群中与疾病相关的真实微生物属（Vandeputte et al. 2017），评估了实际的海洋微生物群谱并确定了关键的代谢物生产者（Lin et al. 2019），测量了不同土壤中的实际微生物群落组成（Tkacz， Hortala 和 Poole 2018），并确定功能性微生物以构建合成微生物群落以提高作物生产力（Chang et al.2017）。微生物组定量分析是迄今为止评估实际复杂微生物群落结构的最终和最佳方法。该方法可以帮助了解微生物相互作用与其代谢潜力之间的关系。食品自然发酵涉及相当复杂的微生物群落。仅仅依靠常规的定量方法无法完全了解微生物群落的实际结构和功能，从而无法有效控制发酵过程。因此，我们应该探索微生物组定量分析在复杂微生物群食品发酵中的进一步应用。在这里，我们提出了微生物组定量分析在食品发酵中的应用前景，如图 4 所示。

(1) 揭示食品发酵中微生物群落的真实结构和演替规律

微生物组定量分析提供了微生物群落中微生物的绝对丰度。它可以更准确地了解不同发酵样品中的不同物种或菌株。它可以揭示不同环境因素发酵过程中真正的差异微生物，并识别出受这些环境因素影响的真正微生物，如季节因素、理化因素或其他干扰因素。例如，它可以识别不同原料发酵过程中真正的差异微生物，揭示原料对微生物群落的影响（Du et al. 2019; Liu et al. 2019a）。它还将反映微生物群中每个分类单元的真实演替规律，揭示活跃的分类单元及其在食品发酵中的活跃阶段。例如，酵母菌被确定为一种活跃的微生物分类群，其最大绝对丰度出现在中国白酒发酵的第 7 天（Wang et al. 2021a）。因此，微生物组定量分析显示出揭示微生物群落的真实结构和演替规律的巨大好处，这对于调控食品发酵至关重要。

(2) 揭示食品发酵微生物群落中的功能微生物

通过将微生物组定量分析与各种相关性分析方法相结合，我们可以进一步揭示微生物与代谢物的关联，例如被认为对食品品质至关重要的风味化合物。与代谢物相关的微生物可以被鉴定为潜在的功能微生物。例如，乳酸杆菌被鉴定为在中国白酒发酵中产生风味化合物（如苯乙酸乙酯和苯乙酸）的功能性微生物（Du、Wu 和 Xu 2020a）。还可以分析微生物与有害代谢物的关联，以揭示这些代谢物的真正生产者，例如食品发酵中的异味化合物和潜在有毒化合物。此外，还可以揭示功能微生物的演替规律，以反映其在发酵中的活跃阶段，便于揭示功能微生物对代谢产物的贡献规律。一旦识别出与有利或有害代谢物相关的功能微生物并揭示其演替规律，将有助于精准调控食品发酵中的功能微生物，从而有利于提高食品品质和安全性。

(3) 定向调控食品发酵中的微生物群落

通过将微生物组定量分析结果与各种因素相关联，包括气候因素、地理因素、加工因素和物理化学因素，我们可以进一步揭示调控食品发酵过程中微生物演替规律的关键驱动因素（Liang et al. 2022; Lin et al. 2022）。例如，通过对微生物群落和气候因素（如风速、日照时长、日平均气温和降水量）的冗余分析，可以评估和识别关键气候因素，并可以用于进一步预测微生物的变化（Wang et al. 2020）。通过揭示地理因素（如经纬度、海拔和坡向），我们可以确定关键的地理因素及其对食品发酵的影响。这将有利于进一步评估和选择特定食品发酵的最佳地理位置（Li et al. 2021）。在揭示了室温和湿度等关键加工因素对中国白酒发酵过程中关键真菌属的影响后，可以通过室温或湿度来预测关键真菌属的数量（Ban et al. 2022）。此外，通过识别影响食品发酵的关键物理化学因素，如pH、温度以及葡萄糖、乳酸和乙酸的含量，通过调节食品发酵中的这些关键因素来控制微生物群落将更加有效。此外，基于真实的关键驱动因素，可以构建更准确的微生物群落预测模型，并利用模型更精确地预测和优化微生物群落。

总之，从微生物组定量分析的角度研究食品发酵中的微生物群落，将使人们更深入地了解食品发酵中微生物群落的结构和功能，它将为控制食品发酵中的微生物群落提供理论依据，这对调节发酵食品的产量和质量具有重要意义。